3세대 유전자가위로 인간 배아에서 돌연변이 유전자 교정 2

요약: 인간 배아세포를 교정하다. 기초과학연구원(IBS) 유전체교정연구단장인 김진수 교수(공동 교신저자), 오레건보건과학대(OHSU, Oregon Health & Science University)의 슈크라트 미탈리포프(Shoukhrat Mitalipov) 교수(공동 교신저자) 등, 한·미 과학자들이, (1) 대대로 유전되어 내려와 젊을 때(20-30대) 비대성 심근증(돌연사)을 일으키는, 4개의 염기 쌍이 망가져 결실된(deleted) 돌연변이 유전자인 MYBPC3를 가진 정자와, (2) 이 변이된 유전자를 자르는 3세대 유전자 가위(Cas9+crRNA)를 리보핵산단백질(RNP)로 조립해(표적 이탈을 줄이기 위해), (1)의 정자와 (2)의 RNP를 동시에 모계의 정상적인 난모세포(oocyte)에 마이크로주입(co-microinjection)하면(모자이크 현상을 피하기 위해), 교정을 위해 외부에서 주입된 인조합성(synthetic) 주형 DNA or gene 도움 없이도, 난모세포가 갖고 있는 대립유전자 염기서열을 템플릿(주형)으로 스스로 이용해서, 유전자 가위에 의해 잘린 정자 유래의 변이 유전자를 정상 염기들로 복구하여(HDR이 NHEJ보다 우세하게 일어나), 그 이후 분열이 일어나 성장된 배아 58개 중 42개(72.4%)가 정상임을 확인하였다. 이 배아들은 착상시키지 않고 폐기함에 따라 유전자가 정상으로 바뀐 아기가 실제로 탄생하지는 않았다.

이 연구 결과는 2017년 8월 2일자 네이처지 온라인판에 논문을 게재했는데, 인간 배아에서의 병을 일으키는 돌연변이 유전자를 교정하는데, 효율성, 정확성, 안전성을 증빙한 것이다. 이 연구 성공으로 심장병을 포함한 1만가지가 넘는 유전질환의 대물림을 막을 수 있는 길을 열었다는 평가를 받고 있다.

안타까운 것은 국내에서는 인간 배아 유전자를 교정하는 연구가 불법이기 때문에, 한국의 유전자 가위 기술을 미국에 보내 미국에서 교정 실험이 이루어졌으며, 실험 후의 데이터 분석은 한국에서 이루어졌고 그 결과를 미국에 보내 종합해서 논문을 발표했다는 것이다. 또한 대부분의 외신은 기술과 데이터 분석을 제공한 김진수 교수 팀보다는 슈크라트 미탈리포프 교수 팀의 성과로 보도했다는 점으로, 우리 나라 관점에서 반성하고 앞으로 나아갈 방향에 시사하는 바가 크다.

이번 연구 내용은 차후 유전자 가위의 응용 및 활용 편에서 자세히 소개할 예정이며 유료보고서로 디자인하여 출간할 예정이다. 본 보고서에서는 이번 발표된 ‘3세대 유전자 가위로 병을 일으키는 인간 배아에서의 돌연변이 유전자 교정’이란 논문을 자세히 분석해보고 나름 대로의 인사이트와 앞으로 나가야 할 방향을 제시하고자 한다. 아울러 논문분석이기 때문에 필자의 지식관점에서 오류가 있을 수도 있다는 점을 분명 알려드리는 바이다.

▲기초과학연구원(IBS) 유전체교정 연구단장이자 서울대 화학부 김진수 교수. (출처: 기초과학연구원)

[글 싣는 순서]

1장 논문 요약, 연구방법 모색 및 비대성 심근증(HCM)을 일으키는 MYBPC3의 돌연변이를 표적 1절 논문 요약 2절 비대성 심근증(HCM)과 현재 치료 방법, 새로운 방법의 고찰 3절 우리 몸의 자연적인 DNA 복구 메커니즘(NHEJ/HDR)과 모자이크 현상 4절 정상인 난모세포와 4개의 염기 쌍이 빠진 정자의 MYBPC3 돌연변이를 표적 5절 난모세포의 대립유전자를 이용 HDR이 우세하게 복구, 정자와 CRISPR-Cas9을 난모세포에 동시에 주입해 모자이크 현상 최소화

2장 4개의 염기 쌍이 빠진(삭제된, 결실된, ΔGAGT) 이형접합적 MYBPC3를 표적 1절 HCM 성인환자의 피부이용 유도만능줄기세포들( iPSCs)에 대한 테스트 2절 RNPs로 난모세포와 정자의 수정란 배아의 교정과 HDR 효율 3절 모자이크를 제거하는 수정 전 생식세포들을 표적 4절 복구(수선, 교정)된 배아의 발달과 세포 유전학 5절 복구(수선, 교정)된 인간 배아들에서의 비-표적(표적 이탈)의 중요성

3장 논문에 기술된 Discussion

4장 인사이트와 차후 도전과제와 생명윤리법 규제완화 1절 인사이트 2절 차후 도전과제 3절 배아교정연구 규제완화와 우리나라의 도전과제

2장 4개의 염기 쌍이 빠진(삭제된, 결실된, ΔGAGT) 이형접합적 MYBPC3를 표적 1절 HCM 성인환자의 피부이용 유도만능줄기세포들( iPSCs)에 대한 테스트

현재 이식하는 심장 제세동기(cardioverter defibrillator) 및 항부정맥제(antiarrhythmic medications)로 관리되고 있으며, MYBPC3의 엑손(Exon) 16에서 이형접합적 우성의 4-bp GAGT 결실(heterozygous dominant 4-bp GAGT deletion(g.9836~9839 del.)로 인해 가족성 HCM을 가진 한 성인 남성 환자가 피부, 혈액 및 정액 샘플들(semen samples)을 기증하기로 동의했다. 피부섬유아세포배양물들(Skin fibroblast cultures)은 이형접합적 환자의 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs)를 생성하는데 사용했다

삭제된 4개의 염기들(ΔGAGT)과 상동 염기들을 엔코딩한 외인성(exogenous, 외부에서 주입하는) 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(single-stranded oligodeoxynucleotide, ssODN-1 & ssODN-2) 템플릿(주형)와 함께 이 특정 MYBPC3의 ΔGAGT 결실을 표적하기 위해 2 개의 단일 가이드 RNA (sgRNA)-Cas9 구성물을 디자인했다(<Extended Data Figure 1a & 1b>). 주형인 두 개의 외인성 ssODN-1과 ssODN-2는 외부에서 주입하는 염기서열로 절단이후의HDR 복구 과정에서 이 외인성을 이용해 복구가 일어날 것이라는 가설에 의해 주입한 것이었다. 또한 정상(WT)인 난모세포의 대립유전자와 차별화를 알아보기 위함이었다.

▲ <EDF 1a와 1b> 크리스퍼-카스9 디자인 및 HCM 성인환자의 피부이용 iPSCs에 대한 테스트(CRISPR–Cas9 design and testing in patient iPSCs). CRISPR–Cas9-1 및 CRISPR–Cas9-2 구성물의 개략도. 이 두 개의 시스템은 단일-체인 키메릭(single-chain chimeric) sgRNA(19bp)+Cas9와 sgRNA(20bp)+Cas9으로 구성. 2 개의 외인성 ssODN-1과 ssODN-2는 HDR 수선을 유도하는 주형(templates). 정상 대립유전자(WT allele)와 구별하기 위해 빨강색으로 표시한 두 개의 단일 염기를 각각의 ssODN에 도입. a의 ssODN-1에는 삭제된 혹은 WT의 4개의 상동 단일 염기들이 밑줄로표시. ssODN-2는 또한 제한효소(BstBI) 인식 사이트를 제공(블랙박스로 표시). Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

각 구성물의 효능(efficacy) 및 특이성(specificity)은 환자 iPSCs에 형질 주입시킴으로써(transfected) 테스트했다. ssODN, Cas9 및 sgRNA 가 모두 발현하는 플라스미드(plasmids)를 전기충격 혹은 전기천공(electroporation) 방법을 이용해 세포들에 주입시켰으며, 그 다음 표적 영역의 각각의 클론(clone)을 시퀀싱으로 분석했다(<Extended Data Figure 1c>).

CRISPR-Cas9-1으로 형질 주입된 61 개의 iPSCs 클론들 중 44 개(72.1 %)는 표적 되지 않았는데(were not targeted), 이는 정상(WT)과 돌연변이 대립유전자(mutant alleles)가 동시에 나타났다는 것(presence)을 말하는 것이다.

▲ <EDF 1c> 크리스퍼-카스9 디자인 및 HCM 성인환자의 피부이용 iPSCs에 대한 테스트(CRISPR–Cas9 design and testing in patient iPSCs). 환자의 iPSCs에 ssODN, Cas9 및 sgRNA 발현 플라스미드를 전기천공법으로 형질 주입시켰으며, 개별 단일 iPSC 클론을 분석함. Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

한편, 첫 번째 CRISPR-Cas9-1을 이용한 표적클론들 17개 중(61-44=17=27.9%) 10개는(10/17=58.8%) NHEJ 기전(기작)에 수선(복구)됐는데, 다양한 인델(indels)을 포함하고 있었다. 나머지 7개 클론들은 ssODN-1을 이용해 HDR로 복구됐는데, 이는 마커 뉴클레오티드 치환물(marker nucleotide substitutions)이 나타난 것으로 판단된다. 따라서, 첫 번째CRISPR-Cas9-1의 총 표적 효율(targeting efficiency)은 27.9%(17/61)였고, 표적 클론들 중 HDR로 41.2% (7/17)가 수선(복구)됐다.

반면, 두 번째 CRISPR-Cas9-2의 표적 효율은 총 23개로 13.1% (23/175) 였고, HDR은 3개로 13% (3/23)로 상당히 낮았다. 3개의 HDR로 수리된 iPSCs 클론들 중 두 개는 ssODN-2 템플릿(주형)을 이용해 복구됐지만, 세번째iPSC 클론은 ssODN-2 주형을 이용하지 않고, 원래 iPSC가 갖고 있던 정상(WT) 서열들을 포함하고 있었는데, 이는 WT 대립유전자를 이용해 HDR로 수선됐음을 나타내는 것이다(<Extended Data Figure 1e>).

▲ <EDF 1e> 크리스퍼-카스9 디자인 및 HCM 성인환자의 피부이용 iPSCs에 대한 테스트(CRISPR–Cas9 design and testing in patient iPSCs). CRISPR-Cas9-1과 CRISPR-Cas9-2 간의 표적 및 HDR 효율성 비교. 별표(*)는 one-tailed Fisher’s test에서 CRISPR-Cas9-2와 비교해 CRISPR-Cas9-1의 표적 효율이 유의하게 높게 나옴(P <0.05). Data: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

연구팀은 이번에는 김진수 교수(공동 교신저자)가 개발한, 플라스미드 대신 사전에 조립되고 재조합된 Cas9 리보핵산단백질(RNP, ribonucleoproteins)이란 혼합체를 iPSCs와 정상(WT) 배아 줄기(ES, embryonic stem) 세포들(H9)에 형질 주입해 CRISPR–Cas9-1과 CRISPR–Cas9-2의 효율을 비교했다.

표적 심층 시퀀싱(Targeted deep sequencing을 통해 CRISPR-Cas9-1이 iPSCs에서 높은 HDR 효율을 보였다. WT의 MYBPC3 대립유전자를 보유하는 WT 배아 줄기 세포들(H9)에서는 표적 돌연변이들(On-target mutations, HDR or NHEJ)이 검출되지 않아, iPSCs에 대한 CRISPR-Cas9-1의 특이성이 높은 것으로 나타났다(<Extended Data Figure 1f>).

왜냐하면 정상(WT) 배아 줄기(ES, embryonic stem) 세포들은 수선할 이유가 없기 때문에, HDR이나 NHEJ로 수선할 필요가 있는 iPSCs에 특이적이라는 것이다. 이러한결과를바탕으로연구팀은후속연구를위해보다높은 HDR 기반 유전자 보정(gene correction) 효율을 갖춘 CRISPR-Cas9-1(이하 CRISPR-Cas9)을 선정했다.

▲ <EDF 1f> 크리스퍼-카스9 디자인 및 HCM 성인환자의 피부이용 ESs와 iPSCs에 대한 테스트(CRISPR–Cas9 design and testing in patient iPSCs). Cas9 리보핵산단백질(RNPs)를 iPSCs와 WT 배아 줄기(ES, embryonic stem) 세포들(H9)에 형질 주입해 CRISPR–Cas9-1과 CRISPR–Cas9-2의 HDR과 NHEJ의 효율을 비교. iPSCs에 대한 CRISPR-Cas9-1이 높은 HDR 효율을 보임. Image: Ma et al., Nature, Published online 02 August 2017.

차원용 소장/교수/MBA/공학박사/미래학자

아스팩미래기술경영연구소(주) 대표, (전)국가과학기술심의회 ICT융합전문위원회 전문위원, 국토교통부 자율주행차 융복합미래포럼 비즈니스분과 위원, 전자정부 민관협력포럼 위원, 국제미래학회 과학기술위원장